3CLPro是冠状病毒复制所必须的酶 可作为有效的抗病毒药物靶点
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3CLPro是冠状病毒复制所必须的酶，可作为有效的抗病毒药物靶点，2003年SARS以来已经有大量的研究基础。Lopinavir与Ritonavir等抗HIV药物也是作用于类似的蛋白酶靶点，并在临床上得到很好的验证。由于人体内没有与3CLPro类似切割位点的蛋白酶，可筛选出高特异性的抑制剂，具有更好的安全性。3CLPro在beta冠状病毒中保守性高，筛选出的3CLPro抑制剂具有广谱抗冠状病毒能力，甚至可能用于猪冠状病毒等其他动物的疾病治疗中。
3CLPro是冠状病毒复制所必须的酶 可作为有效的抗病毒药物靶点
3CLPro是新型冠状病毒（2019-nCoV, SARS-CoV-2）产生的主要的蛋白酶，冠状病毒大多数功能蛋白（非结构蛋白）由ORF1ab基因编码，先翻译成一个多蛋白体（7096aa），再由3CLPro切割成多个有活性的蛋白如病毒复制蛋白RdRp。此外，该蛋白可能切割胞内蛋白NEMO从而抑制干扰素信号途径的活化。因此抑制3CLPro能够有效抑制病毒的感染与复制。▲3CLPro在ORF1ab编码的多蛋白体上有11个切点(Thanigaimalai Pillaiyar)2019-nCoV与SARS-CoV的3CLPro只差12个氨基酸，同源性大于96%，两者结构基本一致（见下图）。3CLPro 识别位点依赖于P1位的Gln。迄今为止没有发现人体内识别Gln的蛋白酶，研究者推测该酶的抑制剂可能有更好的安全性。
▲3CLPro蛋白质结构(Linlin Zhang)
这次疫情中使用的抗HIV药物洛匹那韦（lopinavir）和利托那韦（ritonavir）最早设计用来抑制HIV蛋白酶。2003年SARS期间United Christian医院C M Chu等用于41例SARS治疗，患者死亡率只有2.4%。比较此前的常规治疗过111个非典患者死亡率为28.8%有明显的治疗效果。后来SARS结束，研究没能继续下去。由于新冠病毒3CLPro与SARS-CoV高度同源，这次疫情中这两种抑制剂被寄予厚望，迅速成为网红。表一：在中国临床实验注册中心注册的洛匹那韦（lopinavir）和利托那韦（ritonavir）临床研究值得注意的是，虽然Lopinavir与Ritonavir最早在SARS和MERS治疗中表现出一定的有效性，在新冠肺炎治疗上的有效性仍需谨慎乐观。HIV蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶家族，而冠状病毒蛋白酶为丝氨酸蛋白酶家族，且HIV蛋白酶抑制剂专门针对HIV蛋白酶二聚体口袋优化（见下图左），这个口袋在冠状病毒蛋白酶中并不存在，Nukoolkarn等人通过软对接分析认为两个小分子结合到3CLPpro底物结合位点（下图右红色圆圈，笔者没查到实验证据，如有欢迎留言）。该药物对HIV蛋白酶的抑制活性为1.3 pM(Ki)，对3CLPro抑制活性为15uM(Ki)，体外对SARS病毒的活性浓度分别为4ug/ml和50ug/ml。
由于这次病毒潜伏期长，传染源不明确，专家预测新型冠状病毒可能像流感一样长期与人类共存。2003年以来，研究者针对SARS-CoV、MERS-CoV和这次的2019-nCoV 3CLPro抑制剂做了大量研究工作，在这些工作的基础上寻找更有效的新冠治疗药物不仅仅是当务之急，也是应对人类可能面对的未来风险的必须努力。表二：在clinical trials上注册的3CLPro其他抑制剂临床研究疫情以来，基于3CLPro结构有多篇文章通过计算机模拟虚拟筛选了可能用于新冠肺炎治疗的药物，除上述Lopinavir与Ritonavir外，Kwok-Yin Wong等人通过结构模拟从已经上市的药物中筛选了16个潜在的抗2019-nCoV药物，其中NS5A抑制剂ledipasvir（雷地帕韦） 和velpatasvir（维帕他韦）副作用小，Epclusa (velpatasvir / sofosbuvir（索氟布韦）) and Harvoni (ledipasvir / sofosbuvir)也许有更好的抑制效果。Chen Lingling等人基于3CLPro筛选了32297种潜在的抗病毒药用植物化合物并发现9种可能优化后用于抗COVID-19的治疗效果。Alessandro Contini从3118个FDA已经批准上市的药物中通过虚拟筛选，鉴定出Indinavir、Lopinavir and Atazanavir及Cobicistat（原靶点: CYP3A）等多个潜在的药物。Arun K. Shanker研究了Aza-Peptide Epoxide (APE)作为起始结构的可能。Jared S.Morse等人提示化合物3CLPro-1可以在nM水平上抑制SARS和MERS 病毒3CLPro活性，可能对2019-nCoV 3CLPro有效。Zhijian Xu等认为奈非那韦Nelfinavir可能跟3CLPro结合。
▲Jared S.Morse推荐的针对SARS-CoV 3CLPro抑制剂。
A-C: Lead vinylsulfone protease inhibitors; D: 已有人体数据的3CLPro-1; E-F:在FIPV上验证的3CLPro抑制剂，GC376对SARS-CoV 3CLPro IC50=4.35uM, CC50>150uM, 有很好的安全性。
▲可能抑制3CLPro的几种已上市药物计算机模拟筛选结果（Kwok-Yin Wong）
过去二十年中，人类遭遇三次beta冠状病毒的袭击，虽然SARS-CoV神秘的消失了，基于COVID-19全球蔓延的趋势，而MERS病毒至今没有被控制，开发一种广谱的抗冠状病毒药物成为关系到人类安全的重要任务。由于3CLPro在SARS、MERS病毒和2019-nCoV中高度保守，人类在HIV蛋白酶抑制剂上的成功经验，3CLPro是广谱抗冠状病毒药物的有效靶点。
有趣的是，虽然3CLPro与HIV蛋白酶结构差异非常大，计算机模拟筛选的很多药物为HIV蛋白酶抑制剂。基于纯化的3CLPro蛋白的酶活性验证和结构验证是2019-nCoV蛋白酶抑制剂筛选的重要手段。此外，3CLPro通过切割Dabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans检测灵敏度高，很容易建立高通量筛选体系。
▲Zhang Linlin等人报导的α-酮酰胺类3CLPro抑制剂。针对2019-nCoV的化合物11b抑制3CLPro IC50=0.67uM，并可在类似水平上抑制SARS与MERS。
综上所述，虽然SARS以来科学家在寻找抗冠状病毒药物上断断续续做了一些努力，目前尚无抗新型冠状病毒的特效药物，只能进行支持治疗，依赖患者自愈。但是新型冠状病毒已经形成全球蔓延趋势，截止目前已经在全球29个国家确诊78000多例。目前COVID-19与MERS还没有得到有效的控制，人们必须对其他冠状病毒保持时刻警惕。此外，由于中间宿主不明确、新型冠状病毒潜伏期长，且存在无症状感染等原因，专家推测新型冠状病毒很可能会跟流感一样与人类长期共存。特别希望引起注意的是，这次疫情在武汉地区集中爆发，我们担心新型冠状病毒可能已经传播到周围的其他物种并作为传染源潜伏下来。因此我们认为开发针对3CLPro抑制剂的冠状病毒治疗药物有非常重要的价值与意义。
▲1918年西班牙大流感三次爆发与死亡率（Ali Ekici）。流感第一波在1918年7月达到高峰，然后病死率下降到接近0。到10月，流感再次爆发，病亡率最高接近2.5%。次年2月，流感再次爆发，感染之前没被感染过的人（Wilbur Chen）
特别感谢广东省实验动物监测所提供N蛋白质粒。感谢中科院上海巴斯德研究所钱志康教授、浙江大学黄耀伟教授、复旦大学黄强教授的指导与支持。感谢所有客户的支持，让我们有担当的勇气与力量。
1. Alessandro Contini. Virtual screening of an FDA approved drugs database on tow COVID-19 coronavirus proteins.2. Arun K. Shanker, et.al. Analysis of Whole Genome Sequences and Homology Modelling of a 3C Like Peptidase.3. C M Chu, et.al. Role of lopinavir/ritonavir in the treatment of SARS: initial virological and clinical findings.4. Jared S. Morse, et.al. Learning from the Past: Possible Urgent Prevention and Treatment Options for Severe Acute Respiratory Infections Caused by 2019-nCoV.5. Ling-Ling Chen. Structural basis of SARS-CoV-2 3CLpro and anti-COVID-19 drug discovery from medicinal plants.6. Linlin Zhang, et.al. Alpha-ketoamides as broad-spectrum inhibitors of coronavirus and enterovirus Replication.7. Linlin Zhang, et.al. X-ray Structure of Main Protease of the Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Enables Design of α-Ketoamide Inhibitors.8. Samantha Zinnia Fernandes, et.al. Crystallization fo SARS Coronavirus 3CL protease to identify Inhibitor Targets.9. Si Chen, et.al. Feline Infectious Peritonitis Virus Nsp5 Inhibits Type I Interferon Production by Cleaving NEMO at Multiple Sites.10. Thanigaimalai Pillaiyar,et.al. Recent discovery and development of inhibitors targeting coronaviruses.11. Veena Nukoolkarn. et.al. Molecular dynamic simulations analysis of ritronavir and lopinavir as SARS-CoV 3CLpro inhibitors.12. Xin Liu, et.al. Potential inhibitorsfor2019-nCoV coronavirus M protease from clinically approved medicines.13. Zhijian Xu, et.al. Nelfinavir was predicted to be a potential inhibitor of 2019-nCov main protease by an integrative approach combining homology modelling, molecular docking and binding free energy calculation.
3CLPro是冠状病毒复制所必须的酶 可作为有效的抗病毒药物靶点
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